金線蓮Anoectochilus roxburghii（wall.）lindl為蘭科開唇蘭屬多年生草本，別名金蠶、金線蘭、金線虎頭蕉等，是我國傳統(tǒng)珍貴藥材，素有“金草”“神藥”“烏人參”等美稱，在民間應(yīng)用范圍較廣，廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、高血壓病、糖尿病、腎病等疑難雜癥的治療和強身健體、病后體虛恢復(fù)等方面，在浙江、福建、臺灣等省和東南亞地區(qū)被視為珍稀名貴藥材，特別在臺灣省更是備受青睞，被稱為“藥中之王”［1，2］。

    金線蓮種子微小，由未成熟的胚及數(shù)層種皮細胞構(gòu)成，自然萌發(fā)率和養(yǎng)殖率低，目前市場上貨源主要來自于野生采挖，產(chǎn)品一直處于供不應(yīng)求的狀況。近年來，隨著對其藥效學(xué)和臨床應(yīng)用研究的深入，對金線蓮藥用價值的認(rèn)識進一步提高，其市場貨源緊缺的狀況更為嚴(yán)峻，野生資源也不斷遭到破壞性采挖，以致于處于瀕臨滅絕之地。本研究旨在采用組織培養(yǎng)技術(shù)，解決金線蓮種苗來源，加快人工栽培，以保護金線蓮野生資源、穩(wěn)定市場供應(yīng)。現(xiàn)將有關(guān)實驗結(jié)果如下。
    1、材料與方法
    1.1  材料。無菌養(yǎng)殖體系的建立為浙江金線蓮野生種源，其它實驗為繼代培養(yǎng)的不定芽及無根幼苗莖段。
    1.2 無菌養(yǎng)殖體系的建立。取生長健壯、無病蟲害的植株，去葉后放入低濃度的洗衣粉水中漂洗3～5 min，然后用流水沖洗30 min。在超靜工作臺前，用75% 酒精濕潤5～6 s，放入0.1%的HgCl溶液滅菌12～13 min，用無菌水沖洗5～6次。將消毒好的莖按上段（具莖尖）、中段和下段（匍匐莖段）切成長約1.5～2 cm，帶有1～2個節(jié)間的小段，分別接種于MS+6－BA 4.0 mg/L +NAA 0.4 mg/L 培養(yǎng)基上，pH5.6，蔗糖2.5%，瓊脂0.7%。培養(yǎng)條件為：溫度(25±2）℃ ，光照時間12 h/d，光照強度1 500～2 000 lx。
    1.3  不定芽誘導(dǎo)
    1.3.1  基本培養(yǎng)基對不定芽誘導(dǎo)的影響　采用單因素實驗，培養(yǎng)基選用MS（Murashige-Skoog）［3］，1/2MS（大量元素減半，其他成分不變），VW(Vacin & Went)，B5（Gamborg•Miller & Ojima）和KC(Knudson C)等5種，分別添加6－BA 4.0mg/L，NAA 1.0 mg/L。
   1.3.2  激素對不定芽誘導(dǎo)的影響　以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同種類及濃度的細胞分裂素和生長素。
    上述實驗選取無菌健壯植株，切取長約1～1.5 cm，帶有一個節(jié)間的莖中段，每處理接10個莖節(jié)，重復(fù)3次。培養(yǎng)期間定時觀察不定芽生長情況，培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計不定芽數(shù)。其它條件同實驗“1.2”項。
   1.4  壯苗培養(yǎng)
    1.4.1  激素對幼苗生長和發(fā)根的影響　以1/2MS為基本培養(yǎng)基，NAA設(shè)1～5 mg/L 5個處理，6－BA設(shè)0.5，1.0和1.5 mg/L 3個處理，共15個處理。
    1.4.2  添加物對幼苗生長和發(fā)根的影響以1/2MS＋NAA 2.0 mg/L＋6－BA 0.5 mg/L為基本培養(yǎng)，考察馬鈴薯提取物、香蕉提取物、蘋果提取物、椰子汁等4種天然有機物和活性炭對金線蓮幼苗生長的影響。
    上述每種培養(yǎng)基均接入經(jīng)增殖培養(yǎng)高約3 cm，具3～4節(jié)間、有1～2片的無根幼苗，每處理接種接無根幼苗10株，重復(fù)3次。培養(yǎng)后每隔15 d觀察生長情況1次，至3個月考察每株凈增加的葉片數(shù)、重量及發(fā)根數(shù)，并進行數(shù)理統(tǒng)計分析。
    1.5  移栽  選苗高約6～8 cm，莖基直徑約2 mm，叢生根有2～3條的試管苗，煉苗4 d后，洗凈附著在植株上的培養(yǎng)基，并晾干洗滌水后移人直徑為15 cm，裝有不同基質(zhì)的土盆中，考察不同基質(zhì)對金線蓮試管苗成活率的影響。移栽前，實驗基質(zhì)均用45%多菌靈可濕性粉劑800倍溶液澆透消毒。實驗條件為遮蔭度80%的蔭棚，保持空氣相對濕度的80%～90%。如發(fā)現(xiàn)有病死植株，及時拔除。每處理5盆，每盆種5株，重復(fù)3次，移栽3個月后考察成活株數(shù)，并進行數(shù)理統(tǒng)計分析。
    2、結(jié)果
    2.1 無菌養(yǎng)殖體系的建立  實驗表明，外植體莖段的分化程度對誘導(dǎo)結(jié)果存在一定的影響。從表1可知，上、中段莖均能萌動生長。上段莖因有頂芽的存在，頂端優(yōu)勢表現(xiàn)較為強烈，因而以生長為主，不定芽發(fā)生較少，平均芽增殖數(shù)為0.6個；中段莖不定芽發(fā)生快、量大、長勢好，平均芽增殖數(shù)為4.05個，并形成多枝叢生狀。下段莖由于組織相對老化，雖有不定芽發(fā)生，但發(fā)生量與生長勢均較弱。這和陳自力［4］報道的結(jié)果一致。
    從實驗中觀察到，不定芽的產(chǎn)生以側(cè)芽萌生為主。一般在培養(yǎng)15～20 d后，莖節(jié)上潛伏的葉腋芽萌動膨大，芽叢在節(jié)的四周萌出，起初為白色略帶黃色，隨著培養(yǎng)時間加長，芽不斷伸展，逐漸轉(zhuǎn)為黃綠色，形成主芽。葉腋芽是單生的，極個別節(jié)上能對生兩個腋芽，未發(fā)現(xiàn)莖部或切口處長出不定芽。培養(yǎng)30 d左右，主芽基部的節(jié)再生側(cè)芽(稱一級側(cè)芽)，45 d左右一級側(cè)芽節(jié)上又可發(fā)生二級側(cè)芽，隨著芽的生長、出現(xiàn)葉片，節(jié)處毛并產(chǎn)生根，外被濃密的白色絨毛，從而形成完整小植株。培養(yǎng)3個月后每天觀察，側(cè)芽分生組織的增殖，一般只出現(xiàn)主芽和一二級側(cè)芽或苗；培養(yǎng)5個月以上，主芽、側(cè)芽較高，葉片較多、大，只有少數(shù)出現(xiàn)三級側(cè)芽或苗。這種腋芽萌生的增殖形成了主軸分枝型的芽苗，隨培養(yǎng)時間或繼代養(yǎng)殖代數(shù)的增加，或激素的作用，芽或苗因節(jié)間短，多數(shù)為形成似不定芽或叢生苗。培養(yǎng)過程中，未見愈傷組織，也沒有發(fā)現(xiàn)有原球莖和類原球莖產(chǎn)生。
    表1  金線蓮莖段外植體不定芽誘導(dǎo)（略）
    2.2  不定芽誘導(dǎo)
    2.2.1  基本培養(yǎng)基對不定芽誘導(dǎo)的影響　以金線蓮的莖節(jié)段作為外植體，腋芽能快速萌發(fā)出不定芽體。經(jīng)60 d的培養(yǎng)，增殖倍數(shù)可達3.1～5.4倍。但基本培養(yǎng)基對不定芽的誘導(dǎo)具有明顯的影響，MS，B5培養(yǎng)基不定芽增殖率分別為5.4倍與5.2倍，比其它培養(yǎng)基增加23.8%～74.2%。
    表2  基本培養(yǎng)基對金線蓮不定芽誘導(dǎo)的影響（略）
    經(jīng)LSR差異顯著性測定，MS，B5培養(yǎng)基之間無明顯差異，與1/2MS，KC和VW之間存在極顯著差異，且MS，B5培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽色綠、粗壯（見表2），表明MS，B5培養(yǎng)基適合作為金線蓮莖段不定芽誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基［5］。
2.2.2  激素對不定芽誘導(dǎo)的影響  激素種類、水平與配比對組織培養(yǎng)快速養(yǎng)殖在效率存在明顯的影響，6-BA、KT和NAA是3種常用生長調(diào)節(jié)劑，其添加量對金線蓮不定芽增殖的影響很大。結(jié)果見表3。從表3可知，同為細胞分裂素的6-BA，KT在相同的添加量下對不定芽的增殖效果差異極顯著，6-BA比KT的增殖率提高46.0%和55.0%，表明6-BA比KT更適合金線蓮莖節(jié)不定芽的誘導(dǎo)。
    6-BA的濃度也影響不定芽誘導(dǎo)效果。在添加量小于4.0 mg/L的情況下，隨濃度的提高，不定芽增殖率明顯上升，添加量為4.0 mg/L的不定芽增殖率比2.0，1.0 mg/L分別提高22.1%和47.6%。當(dāng)6-BA添加量達到6.0 mg/L時，其增殖率還出現(xiàn)下降趨勢，表明本實驗條件下6-BA添加的適宜量為4.0 mg/L。
    表3  激素對金線蓮不定芽誘導(dǎo)的影響（略）
    生長素NAA對金線蓮不定芽的誘導(dǎo)與生長具有明顯的促進作用。從表3可以看出，添加了NAA的培養(yǎng)基不定芽增殖量與生長明顯較不添加的好，芽體粗壯、色濃綠，其中添加0.5 mg/L的表現(xiàn)最好，添加1.0 mg/L的其次，但二者間差異未達到顯著水平；與其它不添加NAA的相比差異達極顯著水平。表明在本試驗條件下NAA適宜添加的量為0.5～1.0 mg/L。
    2.3  壯苗培養(yǎng)
    2.3.1  激素對幼苗生長的影響  在金線蓮壯苗培養(yǎng)中，NAA較6-BA對促進幼苗生長的影響更為明顯。結(jié)果見表4。NAA濃度低于3 mg/L時，對幼苗生長有促進作用，隨濃度的增加，葉片凈增量、發(fā)根數(shù)和鮮重凈增量明顯增加，當(dāng)濃度達到4.0 mg/L時，葉片凈增量、發(fā)根數(shù)和鮮重凈增量增加不明顯。6-BA在0.5 mg/L情況下，比不加的具有一定的促進作用，但未達顯著水平；在濃度為1.0 mg/L，1.5 mg/L情況下，葉片凈增量、發(fā)根數(shù)和鮮重凈增量反而減少，但在幼苗基部觀察到叢生狀不定芽的產(chǎn)生，表明6-BA在濃度高于1.0 mg/L情況下，有利于金線蓮不定芽的生成，對幼苗生長不利。
    從表4也可以看出，處理9、10號在發(fā)根數(shù)、鮮生凈增量方面較其它處理明顯提高，達極顯著差異；在葉片凈增量方面，除與處理13、14號無明顯差異外，與其它處理之間的差異達極顯著水平，表明在金線蓮壯苗培養(yǎng)中，NAA適宜添加的量為3.0～4.0 mg/L，6-BA 添加量為0.5 mg/L或不加。
    表4  激素對金線蓮幼苗生長的影響（略）
    2.3.2  活性炭與有機添加物對幼生長的影響  結(jié)果見表5。從表5可知，不同的添加物對金線蓮幼苗生長的影響表現(xiàn)不一，香蕉、椰子汁對促進幼苗生長最為有利，葉片凈增量、發(fā)根數(shù)和鮮重凈增量均高于其它處理，二者間無明顯差異；馬鈴薯對幼苗生長不利，與其它處理相比均存在極顯著差異水平。活性炭對金線蓮幼苗生長具有一定的促進作用，在添加0.3%情況下，葉片凈增量、發(fā)根數(shù)和鮮重凈增量與對照相比均顯著提高，差異達極顯著水平；但與香蕉、椰子汁處理相比，其促進幼苗生長的作用不如前二者，除發(fā)根數(shù)無差異外，葉凈增量與香蕉、椰子汁處理差異達顯著水平，鮮重凈增量差異達極顯著水平。同時觀察到活性炭、香蕉和椰子汁新發(fā)根潔白、粗壯。試驗結(jié)果表明添加20%香蕉和椰子汁最適宜金線蓮幼苗的生長。 
    2.4  移栽  金線蓮試管苗移栽3個月后的植株成活情況見表6。從表6中可以看出，處理7和處理9保持100%的成活率，處理3和處理8的植株成活率也在93%以上，處理1的成活率最低，僅為56%。經(jīng)LSR差異顯著性測定，處理3、7、8、9號之間無明顯差異，與處理5、6號差異達顯著水平、與處理1、2、4號差異達極顯著水平。表明在菜園土中加入粗砂、木屑能明顯提高金線蓮試管苗移栽的成活率，適宜添加的比例為1份菜園土中加入粗砂2份、木屑1份或粗砂1份、木屑2份，要求充分混勻。
    表6  種植基質(zhì)對金線蓮試管苗移栽成活率的影響（略）
    3、小結(jié)
    金線蓮不同部位的莖間對不定芽的誘導(dǎo)結(jié)果存在明顯的差異，以不含頂芽和長根的中間段莖節(jié)為好，不定芽增殖率達4倍以上。
    采用金線蓮中間莖節(jié)作外植體誘導(dǎo)不定芽萌發(fā)時，適宜的培養(yǎng)基為MS或B5＋6-BA 4.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L～1.0 mg/L，蔗糖濃度為2.5%。
    適宜的壯苗培養(yǎng)基為1/2MS＋NAA 3.0 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L＋香蕉提取物20%（或椰子汁20%），蔗糖濃度為3.0%。3.4試管苗在充分混勻的1份菜園土＋2份粗砂（2～3 mm）＋1份木屑，或1份菜園土＋粗砂1份＋木屑2份的基質(zhì)中生長良好，3個月后成活率達100%。