結(jié)果與分析
    3．1孢子粉與孢子囊消毒效果比較
    由表1可知，孢子粉的消毒效果比孢子葉小葉效果差，不僅污染率高，而且容易褐化死亡，繼續(xù)培養(yǎng)無孢子萌發(fā)。小葉的孢子處在孢子囊殼的包被保護(hù)之中，受外界病菌侵染程度輕，表面消毒時(shí)受消毒液的影響也較小。此外，孢子粉個(gè)體微小，表面消毒操作難度大，且由于經(jīng)過干燥散落的后熟過程，夾雜的雜物較多，生活力會有所降低。故以孢子葉小葉整體表面消毒比孢子粉消毒要理想的多。

    3．2不同激素對紫萁孢子萌發(fā)的誘導(dǎo)效應(yīng)。
    由表2可以看出，培養(yǎng)基中激素的濃度高低對孢子萌發(fā)無顯著影響，不加任何激素與附加低濃度激素(低于1.0mg／L)，同樣有很高的孢子萌發(fā)率，但濃度太高(2.0～5.0mg/L)會抑制孢子萌發(fā)。另一方面，無機(jī)鹽濃度對孢子萌發(fā)影響較大，較低的無機(jī)鹽濃度促進(jìn)孢子萌發(fā)，將MS培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度減半是合適的。
    3．3不同糖濃度對孢子萌發(fā)率的影響
    由表3可知，糖濃度對孢子萌發(fā)影響較大，在2%～3%范圍內(nèi)較合適，低于2%和高出4%，孢子萌發(fā)率明顯降低。以食用白砂糖代替化學(xué)純蔗糖，對孢子萌發(fā)率基本上無影響，取材方便，且可降低費(fèi)用成本。
    3．4不同影響因子對原葉體的增殖效應(yīng)
    3．4．1溫度對原葉體的增殖效應(yīng)
    由表4可知，培養(yǎng)溫度對原葉體增殖影響較大，25"C左右是原葉體增值的適宜溫度，低于20"C或晝夜有溫差波動都對原葉體增殖有抑制作用。無機(jī)鹽濃度對原葉體增殖無明顯影響，MS和1／2MS培養(yǎng)基均適合原葉體增殖生長。
    3．4．2活性炭與KH2P04對原葉體的增殖效應(yīng)
    由表5可知，培養(yǎng)基中附加少量活性炭和KH2P04對原葉體增殖和生長有促進(jìn)作用。原葉體在增殖生長過程中，對P、K元素的需求量大，大棚人工播撒孢子養(yǎng)殖試驗(yàn)中，在原葉體增殖生長時(shí)期隔天噴施200mg/LKH2P04溶液代替澆水，對原葉體旺盛生長有明顯的促進(jìn)作用，在組培中效仿也是合適的。活性炭可以吸附培養(yǎng)基中積累的有害物質(zhì)，從而更利于原葉體的增殖和生長。
    3．4．3不同激素對原葉體的增殖效應(yīng)
    由表6可知，不同激素對原葉體增值的影響較明顯。6-BA和NAA在較低濃度時(shí)，對原葉體增殖效果較好，當(dāng)濃度高于2.0mg／L時(shí)反而對原葉體生長不利，出現(xiàn)白化苗現(xiàn)象；2,4-D對原葉體增殖效果較好，但片狀體皺褶嚴(yán)重，不舒展飽滿；高濃度的KT有利于原葉體的增殖和生長。 
    由表7可知，6-BA0.5mg／L+NAA0.5mg/L、6-BA1.0mg／L+NAA0.5mg／L、NAA0.5mg／L+KT5.0mg／L和NAA1.0mg／L+KT5.0mg／L都能促進(jìn)原葉體增殖，并能生長良好。6-BA0.5mg／L+NAA1.0mg／L分化出假根的能力最強(qiáng)，可用于孢子體生根培養(yǎng)基。 
    3．5煉苗與移栽
    孢子囊無菌培養(yǎng)約四個(gè)月后，在濃綠肥厚的原葉體上開始出現(xiàn)幼孢子體，在培養(yǎng)基營養(yǎng)供給充足的條件下，20d左右即可進(jìn)行煉苗．由于離體條件培養(yǎng)下的再生植株長期在營養(yǎng)豐富的無菌條件下生長，根系活動能力低，直接移入土壤中栽培對外界環(huán)境適應(yīng)力極差，成活率極低。在培養(yǎng)室條件下選擇3條根以上、根系粗壯、3葉以上且葉長3～4cm的綠色完整植株，置于大量元素稀釋100倍的培養(yǎng)液浸泡過的干凈沙礫中培養(yǎng)一周，其間要經(jīng)常用純凈水清洗去根上殘余的瓊脂，不斷補(bǔ)充培養(yǎng)液，使植株逐漸適應(yīng)外界環(huán)境．再轉(zhuǎn)移至室內(nèi)自然條件下培養(yǎng)一周后，接入配備好的砂土中栽植，細(xì)心管理，半個(gè)月后可移至室外，成活率可達(dá)80%。另在遮陽網(wǎng)大棚內(nèi)保持濕度90%以上，保持溫度20-28℃，散射光照條件下，以同樣基質(zhì)煉苗移栽，效果也較好，成活率可達(dá)60%。煉苗時(shí)間過短，砂培改為水培，成活率均有下降。 
    討論與小結(jié)
    紫萁孢子無菌培養(yǎng)途徑孢子囊萌發(fā)率高，質(zhì)地均一，生長勢良好，沒有病害壞死等不良癥狀，但存在成本高、耗費(fèi)人工、煉苗時(shí)間較長導(dǎo)致成活率下降等缺點(diǎn)。無菌培養(yǎng)技術(shù)，目前還處在摸索階段，不能將被子植物組織培養(yǎng)技術(shù)直接照搬。被子植物從外植體到成苗移栽一般只需帥天左右，紫萁屬較低等的蕨類植物，有其獨(dú)特的生活史，自然條件下從孢子成熟到萌發(fā)成孢子體需四個(gè)月左右，到基本上能移栽到大田栽培則共需要約六個(gè)月。目前的無菌培養(yǎng)技術(shù)和溫室基質(zhì)育苗都很難顯著縮短其生活周期，只能作為補(bǔ)充自然生態(tài)環(huán)境下資源不足的人工養(yǎng)殖手段。
    孢子粉的消毒效果比孢子葉小葉效果差，不僅污染率高，而且容易褐化死亡，繼續(xù)培養(yǎng)無孢子萌發(fā)。孢子葉小葉整體表面消毒比孢子粉消毒要理想的多。激素濃度高低對孢子萌發(fā)無顯著影響，不加任何激素與附加低濃度激素(低于1.0mg/L)，同樣有很高的孢子萌發(fā)率，但濃度太高(2.0~5.0mg/L)會抑制孢子萌發(fā)．無機(jī)鹽濃度對孢子萌發(fā)影響較大，較低的無機(jī)鹽濃度促進(jìn)孢子萌發(fā)，將MS培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度減半是合適的。
    糖濃度對孢子萌發(fā)影響較大，在2%～3%范圍內(nèi)較合適，低于2%和高出4%，孢子萌發(fā)率明顯降低。以食用白砂糖代替化學(xué)純蔗糖，對孢子萌發(fā)率基本上無影響。
    溫度對原葉體增殖影響較大，25"C左右是原葉體增值的適宜溫度，低于20"C或晝夜有溫差波動都對原葉體增殖有抑制作用。無機(jī)鹽濃度對原葉體增殖無明顯影響，MS和1／2MS培養(yǎng)基均適合原葉體增殖生長。培養(yǎng)基中附加少量活性炭和KH2P04對原葉體增殖和生長有促進(jìn)作用。
    6-BA和NAA在較低濃度時(shí)，對原葉體增殖效果較好，當(dāng)濃度高于2.0mg／L時(shí)反而對原葉體生長不利，出現(xiàn)白化苗現(xiàn)象；2,4。D對原葉體增殖效果較好，但片狀體皺褶嚴(yán)重，不舒展飽滿：高濃度的KT有利于原葉體的增殖和生長。6-BA0.5mg／L+NAA0.5mg／L、6-BA1.0mg／L+NAA0.5mg／L、NAA0.5mg，L+KT5.0mg／L和NAA1.0mg／L+KT5.0mg/L都能促進(jìn)原葉體增殖，并能生長良好，具體哪一種促進(jìn)原葉體增殖效果最好，還有待進(jìn)一步深入研究。6-BA0.5mg／L+NAA1.0mg／L分化出假根的能力最強(qiáng)，可用于孢子體生根培養(yǎng)基。
    此外，培養(yǎng)基的質(zhì)地對原葉體的快速增殖也影響較大。表面有水漬，質(zhì)地膨松，輕敲有晃動感，挖去一小塊即有明水填充的培養(yǎng)基，原葉體增殖比質(zhì)地堅(jiān)硬的培養(yǎng)基要明顯加快，長出孢子體的時(shí)間要早10d左右，且生長狀況良好。
    原葉體增殖培養(yǎng)是紫萁孢子萌發(fā)途徑中最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，只有原葉體生長狀況良好，積累足夠的養(yǎng)分，在外界條件合適的情況下，才能完成受精產(chǎn)生孢子體。如何縮短原葉體增殖周期，盡量節(jié)約成本，提前出苗，將是紫萁孢子萌發(fā)培養(yǎng)中的重要議題。