【摘要】目的用超低溫方法保存青天葵組培物。方法采用單因子比較法、均勻設計法考察生長周齡、冷凍保護劑、預培養(yǎng)時間、降溫方式、化凍方式等因素對青天葵組培物超低溫保存后細胞生活力的影響。結果青天葵組培物較佳的超低溫保存程序為：5周齡的組培物，在4℃進行低溫鍛煉12d，以12.5%DMSO＋0.25%LH為冷凍保護劑，在4℃靜置處理30min，然后在-18℃，停留1h后投入液氮中保存，材料取出后，在20℃化凍，無菌洗滌后，再接種，組培物能夠存活并繼續(xù)生長。結論超低溫保存方式可以成功保存青天葵組培物種質資源。 

    青天葵別名獨葉蓮、青蓮、天葵、芋蘭等，來源于蘭科多年生宿根草本植物毛唇芋蘭Nerviliafordii（Hance）Schltr，以葉或帶塊莖的葉入藥[1]，有清肺止咳、健脾消積、鎮(zhèn)靜止痛、清熱解毒、散結消疬之功效，主治肺癆、咳嗽咳血、瘰疬、腫毒、跌打損傷、小兒疳積、精神病、口腔炎、急性咽喉炎等，對小兒肺炎有特效。 
    由于青天葵種子無胚乳，僅靠無性養(yǎng)殖，自然養(yǎng)殖數(shù)量少，養(yǎng)殖系數(shù)極低，資源分布極其有限。多年來，因亂采亂挖，多是連葉帶塊莖采挖加工，導致野生青天葵資源日益枯竭。 
    我們已經(jīng)開展青天葵組織培養(yǎng)及植株再生的研究工作[2]，本研究青天葵組培物超低溫保存的影響因素，為青天葵資源再生和種質保存提供技術資料和理論依據(jù)。
    1、材料與方法
    1.1材料本實驗所用青天葵組培物是由青天葵球莖誘導產(chǎn)生的根狀莖。在含有6-BA2mg•L-1的MS培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，每天光照12h，光照強度1200Lx。經(jīng)不同周齡對比試驗后，采用5周齡的組培物作為超低溫保存的試驗材料。
    1.2方法
    1.2.1冷凍保護劑考察DMSO，Gly（甘油），PEG（聚乙二醇），Suv（蔗糖），Glu（葡萄糖），LH（水解酪蛋白）6種冷凍保護劑及其不同濃度配比的冷凍保護效果。
    1.2.2預培養(yǎng)將組培物轉至含5%DMSO（二甲基亞砜）的MS培養(yǎng)基上，置于4℃進行零上低溫鍛煉?？疾煸诖藯l件下預培養(yǎng)時間對超低溫保存后細胞生活力的影響。
    1.2.3冷凍程序將組培物放入5ml聚乙烯塑料冷凍管中，加入0℃預冷的保護劑，使之淹沒組培物，旋緊管塞，在4℃靜置處理30min。然后將冷凍管放入-18℃，停留一定時間后投入液氮中保存?？疾煸?18℃溫度下停留不同時間（0.5，1，2，3，4，5，6，7，8h），對超低溫保存后細胞生活力的影響。
    1.2.4化凍與洗滌材料從液氮中取出化凍?？疾觳煌幕瘍龇绞剑?℃零上低溫，10，20，30，40，50，60，70℃的化凍效果。 
    待冷凍管中的冰融化后，立即加入MS培養(yǎng)液（大量元素＋3%蔗糖），輕輕振搖，停留10min，傾出溶液，如此反復洗滌3～5次。
    1。2.5細胞生活力的檢測按簡令成[3]報道的方法：稱取洗滌后的組培物200mg，加入5ml氯化三苯四氮唑（TTC）液，在黑暗條件下靜置染色20h。吸去TTC液，用蒸餾水洗滌3次。加入丙醇研磨提取TTC被脫氫酶還原后生成的紅色甲。用755型分光光度計，在490nm處測試丙醇提取液的吸收值。用這個吸收值（TTC）值表示各處理的愈傷組織經(jīng)超低溫保存后的細胞生活力。
    2、結果分析
    2.1組培物生長周齡對超低溫保存后細胞生活力的影響細胞抗凍能力的提高與其分裂和生長活動等生理狀態(tài)密切相關。取轉移到新鮮培養(yǎng)基上的組培物，考察不同的生長周齡（1，2，3，4，5，6，7周）對組培物經(jīng)超低溫保存后的細胞生活力。
    由圖1知，將組培物轉移至新鮮培養(yǎng)基上，開始1周，冷凍后細胞的TTC值較低，說明細胞的抗凍能力弱，培養(yǎng)至第2周時，TTC值迅速升高，細胞抗凍能力顯著增強，第5周的TTC值最高，此時細胞的抗凍能力最強，此后，隨著培養(yǎng)周齡的增加，TTC值呈下降趨勢，細胞抗凍能力逐漸減弱。因此選擇5周齡的組培物作為超低溫保存的材料是適宜的。
    2.2冷凍保護劑對超低溫保存后細胞生活力的影響結果見表1～2。
    表1U12（12）12均勻設計因子水平（略）
    按表1均勻設計搭配，組合成12種方案進行試驗，結果見表2。
    表2U12（12）12均勻設計實驗安排及結果（略）
    數(shù)據(jù)經(jīng)逐步回歸處理，得到方程Y=0.369＋0.004x12＋4.495x62，R=0.907>0.9，F(xiàn)=20.925>F（7，4）=14.68，方程有顯著性意義。由方程知，X12和X22對XY值有顯著影響，均與Y值呈正相關。對方程優(yōu)化得X1=12.5，X6=0.25，將其代入方程，得到優(yōu)化值1.275，按公式計算。當α=0.10，Uα=1.6448，計算優(yōu)化值區(qū)間估計為Y=1.275±1.6448×0.12，即1.078～1.472。按照優(yōu)化條件進行試驗，得到TTC值為1.281，在Y值區(qū)域內，且比12次均勻試驗Y值都高，說明所得結果是正確的，因此認為12.5%DMSO＋0.25%LH是青天葵組織培養(yǎng)物較佳的冷凍保護劑。
    2.3組培物預培養(yǎng)時間對超低溫保存后細胞生活力的影響結果見圖2。圖2表明，未經(jīng)預培養(yǎng)的組培物，細胞TTC值最低，抗凍能力較弱，預培養(yǎng)3d后，TTC值開始上升，細胞抗凍能力逐漸增強，到12d時TTC值達最大，此時細胞抗凍能力最強，此后延長預培養(yǎng)時間，TTC值呈下降趨勢，因此試驗材料應在4℃預培養(yǎng)12d后再進行超低溫保存。
    2.4降溫方式對超低溫保存后細胞生活力的影響實驗比較快凍法（從0℃直接投入液氮中保存）和兩步冷凍法的冷凍效果，著重考察兩步法中在-18℃停留不同時間（0.5，1，2，3，4，5，6，7，8h）對冷凍保存后細胞生活力的影響。結果見圖3。
    圖3降溫方式對冷凍后細胞生活力的影響（略） 
    圖3表明，兩步冷凍法的效果優(yōu)于快速冷凍法，采用兩步冷凍法從0℃緩慢降溫至-18℃時，不立即投入液氮中而在此溫度下停留1h，冷凍后細胞生活力明顯提高，因此降溫方式以從0℃降溫至-18℃，停留1h，然后投入液氮保存。
    2.5化霜凍方式對超低溫保存后細胞生活力的影響結果見圖4。圖4表明，冰箱內4℃化凍和40℃以上高溫化凍的TTC值較低，細胞生活力較弱，10℃和30℃化凍效果接近，20℃化凍TTC值最高，說明化凍后細胞保持了較高的生活力，因此20℃化凍是較好的化凍方式。
    圖4化凍方式對冷凍后細胞生活力的影響（略）
    2.6超低溫保存后組培物的再生長將化凍后的組培物，用無菌的MS液沖洗后，轉移至新鮮培養(yǎng)基上，先黑暗培養(yǎng)2周，后進行光照培養(yǎng)，組培物能夠存活，統(tǒng)計存活率為66.7%，將其轉移至新的培養(yǎng)基上根狀莖可以繼續(xù)生長并有新的根狀莖從節(jié)的部位生出。
    【參考文獻】
    ［1］江蘇新醫(yī)學院。中藥大辭典，上冊［M］。上海：上?？萍汲霭嫔纾?993：1231。
    ［2］杜勤，陳文利，王振華，等。青天葵組織培養(yǎng)和植株再生研究［J］。中國中藥雜志，2005，3（1）：812。
    ［3］簡令成，孫德蘭，孫龍華。甘蔗愈傷組織超低溫保存中一些因素的研究［J］。植物學報，1987，29（2）：123。