摘要：以中國櫻桃品種泰山干櫻為試材，利用李屬植物C2、C5保守區(qū)引物，擴增花柱，S-RNase基因，獲得4個S等位基因，測序結果表明序列大小分別為：1608、950、796、504bp。根據同源比較發(fā)現大小為796 bp的等位基因與基因庫中登錄的SI—RNase為同一基因，其它3個S-RNase基因為首次報道，依序列大小分別命名為S2(1608 bp，登陸號EF541168)、S4(950bp，登陸號EF541173)和S6(504 bp，登陸號EF541172)。序列分析表明S2-RNase在C3區(qū)存在終止密碼子，導致翻譯提早終止；S4-RNase的C5區(qū)前有插入片斷；S6-RNclse在高變區(qū)比其它S等位基因少一個氨基酸殘基。氨基酸序列同源性比較分析表明，中國櫻桃S—RNase與櫻花、扁桃的相似性高。在系統(tǒng)進化樹中中國櫻桃的4個S-RNase基因的氨基酸序列和櫻花、扁桃、甜櫻桃、酸櫻桃等一起歸于李亞科。

    關鍵詞：中國櫻桃；自交親和；S-RNase；序列；系統(tǒng)樹
    中圖分類號：S662.5 文獻標識碼：A
    文章編號：1009-9980(2008)03-332-06
    薔薇科的多數果樹，如蘋果、梨、甜櫻桃等的絕大多數品種均表現為典型的配子體自交不親和性，這對于以收獲果實為目的的果樹來說，自花不結實或結實率低無疑是不利的，生產上常因授粉樹配置不當、人工授粉不及時或花期遭遇不良氣候而影響昆蟲傳粉造成減產。因此闡明果樹自交親和與不親和的分子機制、篩選和培育自交親和品種成為國內外科學家的重要研究目標。
    在薔薇科果樹中。李屬植物因其S位點區(qū)域的物理距離小而成為GSI研究的模式植物，櫻桃更以其天然存在自交親和與不親和、二倍體與多倍體的完整系統(tǒng)而成為研究李屬植物自交親和與不親和性作用機制及關系演變的理想材料。目前，世界上普遍栽培的櫻桃有4個種，其中歐洲甜櫻桃以其味美、外形美觀等特點深受消費者喜愛，是經濟栽培的主要對象。因其表現為自交不親和成為自交不親和研究的重要材料，國內外有關其基因型鑒定、花柱S-RNase基因克隆表達及遺傳特性、花粉SFB(S locus F-box)基因的克隆表達等研究均有報道；而同為栽培種的中國櫻桃，作為我國特有的果樹種質資源，與歐洲甜櫻桃在自交親和性及不親和性上表現截然不同，為四倍體植株，表現自交親和性，但是在國際范圍內，尚未見有關其自交親和性分子基礎的研究報道。因此，我們以中國櫻桃品種泰山干櫻為試材，開展花柱S-RNase基因的克隆和序列分析，研究結果對于深入了解其自交親和遺傳信息，進一步探討自交親和的分子機理具有重要意義，同時也將為實現甜櫻桃的自交親和性品種選育提供參考。
    1、材料和方法
    1．1、材料
    供試中國櫻桃品種泰山干櫻來自山東省果樹研究所，春季選取幼嫩葉片，于液氮中速凍，置20℃冰箱貯藏備用。
    1．2、基因組DNA提取
    基因組DNA提取采用改良CTAB法。
    1．3、引物設計
    采用已發(fā)表的櫻桃S-RNase基因的C2區(qū)和C5區(qū)設計的通用引物Pru-C2/Pru-C5。由上海博亞生物技術有限公司合成，序列分別為：Pru-C2：5’CTATGGCCAAGTAATFATrCAAACC 3’，Pru-C5：5’CAAAATACCACTFCATGTAACAAC 3’。
    1．4、PCR擴增及檢測
    引物Pru-C2/Pru-C5 PCR反應體系為25 μL，包含10×PCRBuffer，MgCl22 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，引物各0.15 μmol/L，Taq酶1 U，模板50 ng。反應條件為：94℃預變性3 min；33個循環(huán)的94℃變性60 s，56℃退火45 s，72℃延伸1.5 min：最后72℃延伸10　min。
    PCR產物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。
    1．5、S基因擴增片段的克隆、測序
    將擴增產物連接到PMD-19載體中，轉入感受態(tài)DH5α大腸桿菌中進行克隆。藍白斑篩選挑取陽性克隆，對菌液進行PCR檢測，用1.5％的瓊脂糖電泳檢測產物，確定插入片斷為目的片段，提取質粒送上海博亞生物技術有限公司測序。
    1．6、序列比較和系統(tǒng)樹的構建
    利用軟件DNAMAN對克隆的序列進行同源性比較；并利用Mega3.1對25個薔薇科、茄科、玄參科的S-RNase序列做多重比較，以鄰位相連法(neigh-bor-joining method)構建系統(tǒng)進化樹。
    1．7 、自交親和性的授粉試驗
    于開花前1d或當天采集花蕾，取出花藥。待其自然開裂，花粉散出后，收集花粉備用。對當天即將開花的花蕾在散粉前去雄，同時疏去一些生長較弱的花蕾，進行授粉套袋，每組合250朵花。授粉后72 h，隨機選取10朵花，從花柱基部切取花柱，用FAA固定，利用熒光顯微鏡觀察花粉原位萌發(fā)及花粉管生長情況，方法參照Kho等，并進行顯微拍攝，每個處理重復10根花柱。套袋后1周去袋，1個月后統(tǒng)計坐果率。
    2、結果與分析
    2．1、泰山干櫻S-RNase基因的特異PCR擴增
    用Pru-C2/Pru-C5引物對泰山干櫻的基因組DNA進行PCR擴增，圖譜中可擴增出4條特異片斷，這與中國櫻桃為四倍體植株是相符合的，即存在4個S等位基因。擴增片斷大小范圍在1 700~600 bp，為了便于對這4個目的條帶進行進一步的分析研究，我們將其分別命名為A、B、C、D。
    2．2、泰山干櫻S-RNase基因的同源性比較
    為進一步分析擴增產物的序列特征，對目的片斷回收、克隆并測序。測序結果表明，特異片斷A、B、C、D的大小分別為：1 658、1 001、846、565 bp。將序列結果在NCBI上同源比較，發(fā)現4個基因與李屬植物櫻花、扁桃、甜櫻桃的S-RNases同源性在77.25％～98.31％(表1)，具有較高的同源性，可確定擴增片斷均為S-RNases的等位基因。其中片斷C與吳燕等(www.ncbi.nih.gov)在中國櫻桃平都長把紅中得到并登陸的S1-RNase同源性100％，2者應為同一S等位基因。在本試驗中由于設計引物位置的變化，擴增片斷長出117 bp，因此我們將片段C命名為S1，為了進一步增加S基因的遺傳信息，該序列信息也登錄在基因庫，登錄號為：EF541170。而A、B、D 3個擴增片斷均為首次發(fā)現的S等位基因，依片斷大小分別命名為S2 RNase、S4-RNase、S6-RNase(S3，S5為本實驗室登陸的其它品種的S-RNase基因)，在 1 [2] 原版全文